Les activités du CRB du CEPH

Une validation technique des protocoles, associée à l’utilisation d’une base de données développée en interne et adaptée à l’activité, ainsi que des procédures qualité, mises en place depuis la réception des échantillons biologiques jusqu’à l’envoi des échantillons transformés aux centres demandeurs, garantissent la traçabilité, la reproductibilité et la qualité des matériels biologiques. Le manuel qualité du CRB est disponible sur demande auprès du responsable du CRB.

Le CRB peut proposer une organisation permettant l'inclusion de volontaires dans un projet de recherche. Une base de données dédiée à la collecte et permettant de garantir la traçabilité de celle-ci peut être adaptée aux besoins des collaborateurs.

Le CRB reçoit des prélèvements transportés de manière à conserver l’intégrité des matériels biologiques en utilisant des conditionnements et moyens de transport conformes à la réglementation internationale en vigueur. Chaque prélèvement réceptionné est contrôlé puis enregistré dans la base de données du CRB.

Les échantillons arrivés congelés sont enregistrés en vapeur d'azote, pour permettre de conserver leur qualité. Cette étape est réalisée dans le Cryocart MVE partiellement rempli d'azote liquide.  

Toutes les opérations de transformation d’un échantillon biologique en produits dérivés sont enregistrées dans la base de données du CRB. Chaque matériel transformé fait l’objet d’une nouvelle identification, ce qui permet une traçabilité de l’arborescence et du mode de fabrication des échantillons. L’utilisation de lecteurs de codes à barres à chaque étape des manipulations permet de limiter au maximum les risques d’erreurs.

L’isolement des lymphocytes du sang périphérique est réalisé sur gradient de densité en ficoll en vue d’une immortalisation ultérieure par infection des lymphocytes B par le virus d’Epstein Barr. Des culots lymphocytaires de plusieurs dizaines de millions de cellules peuvent ensuite être produits en vue de l’extraction ultérieure d’ADN, d’ARN ou de protéines.

Les ADN sont isolés sur des automates Chemagic ™ Prime ™ (PerkinElmer) permettant leur extraction à partir de sang frais ou congelé, de salive, de tissus congelés ou de culots lymphocytaires, en utilisant la méthode des billes magnétiques. Les ADN sont quantifiés en fluorimétrie et dilués pour obtenir une concentration normalisée.

Les ARN sont extraits de manière semi-automatisée à partir de tissu ou de sang PAXgene congelés par passage sur une membrane de silice. Les ARN sont quantifiés en spectrophotométrie.

Un contrôle systématique, de la non-contamination par des mycoplasmes, des lignées conservées ou transmises par des laboratoires extérieurs est réalisé lors de chaque décongelation en vue d’une expansion cellulaire.

Des contrôles de qualité sont réalisés sur environ 10% des ADN traités dans le CRB sur un Fragment Analyzer (Agilent):

• intégrité de l'ADN,

• contrôle du caractère amplifiable de l'ADN et du genre ainsi que la vérification de la correspondance avec les données transmises.

Un contrôle de l’authenticité de l’échantillon peut également être réalisé. La qualité des ARN est évaluée par mesure du RIN (RNA Integrity Number).

Le CRB a mis en place une activité de poinçonnage de buvard pour tests de sérologie sur un Panthera (PerkinElmer).

Les échantillons biologiques sont conservés :

• dans des congélateurs à -30°C, pour des kits salivaires, des sangs séchés sur buvards,

• dans des congélateurs à -80°C, pour les tissus, plasma, sérum, ARN et ADN, sangs en attente d’extraction,

• dans l’azote liquide à -196°C, pour les fractions lymphocytaires, lignées cellulaires viables, et certains plasmas, érythrocytes, serum, buffy-coat

• à température ambiante pour les prélèvements de salive stabilisés.

Afin de renforcer la sécurité des matériels biologiques (ADN, PBL ou lignées), ceux-ci sont, dans la mesure du possible, aliquotés en au moins deux tubes et conservés dans deux enceintes réfrigérées distinctes.

Un système automatisé de contrôle et d’enregistrement continu des températures permet la surveillance de tous les équipements de conservation du CRB (température ambiante, 4°C, -20°C, -30°C, -80°C, -196°C, incubateurs à CO₂). En cas de problèmes de température, ce système sécurisé est couplé à une alarme qui engendre une intervention immédiate.

Les échantillons sont conservés dans des pièces dédiées d'accès restreint. Dans le cas où un dysfonctionnement interviendrait dans un des congélateurs, un équipement de secours, en fonctionnement, localisé dans cette même pièce, est utilisé pour sauvegarder les échantillons.

Les cryo-conservateurs de grande taille (15.000 - 30.000 tubes cryogéniques par conteneur) sont automatiquement alimentés en azote à partir d’un réservoir central et contrôlés par télésurveillance. 

Les matériels biologiques sont distribués conformément à la politique définie dans le cadre de chaque projet et à la réglementation en vigueur. Les envois sont réalisés en respectant les conditions de température appropriées au matériel biologique.