Les activités du CRB du CEPH



Le CRB a envoyé en 2021 près de 52 000 échantillons biologiques à ses collaborateurs.


Plusieurs dizaines de milliers d’échantillons sont reçus chaque année dans le cadre de nombreux programmes. Le nombre de prélèvements à traiter, et la diversité des projets de recherche pour lesquels les échantillons sont pris en charge, nécessitent une expertise technologique et une grande standardisation.

Une validation technique des protocoles, associée à l’utilisation d’une base de données développée en interne et adaptée à l’activité, ainsi que des procédures qualité, mises en place depuis la réception des échantillons biologiques jusqu’à l’envoi des échantillons transformés aux centres demandeurs, garantissent la traçabilité, la reproductibilité et la qualité des matériels biologiques. Le manuel qualité du CRB est disponible sur demande auprès du responsable du CRB.

Le CRB travaille, à chaque étape du processus, en étroite collaboration avec le coordinateur de l’étude, de manière à mettre en place des collections de matériels biologiques de qualité associés à des données fiables et à permettre des analyses ultérieures pertinentes.



La constitution de collections

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Le CRB peut proposer une organisation permettant l'inclusion de volontaires dans un projet de recherche. Une base de données dédiée à la collecte et permettant de garantir la traçabilité de celle-ci peut être adaptée aux besoins des collaborateurs.


La réception des échantillons

Le CRB reçoit des prélèvements transportés de manière à conserver l’intégrité des matériels biologiques en utilisant des conditionnements et moyens de transport conformes à la réglementation internationale en vigueur. Chaque prélèvement réceptionné est contrôlé puis enregistré dans la base de données du CRB.

Les échantillons arrivés congelés sont enregistrés en vapeur d'azote, pour permettre de conserver leur qualité. Cette étape est réalisée dans le Cryocart MVE partiellement rempli d'azote liquide.

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Les transformations des matériels biologiques

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Toutes les opérations de transformation d’un échantillon biologique en produits dérivés sont enregistrées dans la base de données du CRB. Chaque matériel transformé fait l’objet d’une nouvelle identification, ce qui permet une traçabilité de l’arborescence et du mode de fabrication des échantillons. L’utilisation de lecteurs de codes à barres à chaque étape des manipulations permet de limiter au maximum les risques d’erreurs.

L’isolement des lymphocytes du sang périphérique est réalisé sur gradient de densité en ficoll en vue d’une immortalisation ultérieure par infection des lymphocytes B par le virus d’Epstein Barr. Des culots lymphocytaires de plusieurs dizaines de millions de cellules peuvent ensuite être produits en vue de l’extraction ultérieure d’ADN, d’ARN ou de protéines.

Les ADN sont isolés sur des automates Chemagic ™ Prime ™ (PerkinElmer) permettant leur extraction à partir de sang frais ou congelé, de salive, de tissus congelés ou de culots lymphocytaires, en utilisant la méthode des billes magnétiques. Les ADN sont quantifiés en fluorimétrie et dilués pour obtenir une concentration normalisée.

Les ARN sont extraits de manière semi-automatisée à partir de tissu ou de sang PAXgene congelés par passage sur une membrane de silice. Les ARN sont quantifiés en spectrophotométrie.




Les contrôles de qualité

Un contrôle systématique, de la non-contamination par des mycoplasmes, des lignées conservées ou transmises par des laboratoires extérieurs est réalisé lors de chaque décongelation en vue d’une expansion cellulaire.


Des contrôles de qualité sont réalisés sur environ 10% des ADN traités dans le CRB sur un Fragment Analyzer (Agilent):

  • intégrité de l'ADN,

  • contrôle du caractère amplifiable de l'ADN et du genre ainsi que la vérification de la correspondance avec les données transmises.


Un contrôle de l’authenticité de l’échantillon peut également être réalisé. La qualité des ARN est évaluée par mesure du RIN (RNA Integrity Number).

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Le poinçonnage de buvards (punchs)

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Le CRB a mis en place une activité de poinçonnage de buvard pour tests de sérologie sur un Panthera (PerkinElmer).



Le génotypage SNP

Le CRB réalise le génotypage de marqueurs de type SNP (Single Nucléotide Polymorphisme) en plaque 96 puits sur un QuantStudio3TM (AppliedBiosystems).



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Le stockage

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Les échantillons biologiques sont conservés :

  • dans des congélateurs à -30°C, pour des kits salivaires, des sangs séchés sur buvards,

  • dans des congélateurs à -80°C, pour les tissus, plasma, sérum, ARN et ADN, sangs en attente d’extraction,

  • dans l’azote liquide à -196°C, pour les fractions lymphocytaires, lignées cellulaires viables, et certains plasmas, érythrocytes, serum, buffy-coat

  • à température ambiante pour les prélèvements de salive stabilisés.


Afin de renforcer la sécurité des matériels biologiques (ADN, PBL ou lignées), ceux-ci sont, dans la mesure du possible, aliquotés en au moins deux tubes et conservés dans deux enceintes réfrigérées distinctes.

Un système automatisé de contrôle et d’enregistrement continu des températures permet la surveillance de tous les équipements de conservation du CRB (température ambiante, 4°C, -20°C, -30°C, -80°C, -196°C, incubateurs à CO₂). En cas de problèmes de température, ce système sécurisé est couplé à une alarme qui engendre une intervention immédiate.

Les échantillons sont conservés dans des pièces dédiées d'accès restreint. Dans le cas où un dysfonctionnement interviendrait dans un des congélateurs, un équipement de secours, en fonctionnement, localisé dans cette même pièce, est utilisé pour sauvegarder les échantillons.

Les cryo-conservateurs de grande taille (15.000 - 30.000 tubes cryogéniques par conteneur) sont automatiquement alimentés en azote à partir d’un réservoir central et contrôlés par télésurveillance.


La mise à disposition des échantillons

Les matériels biologiques sont distribués conformément à la politique définie dans le cadre de chaque projet et à la réglementation en vigueur. Les envois sont réalisés en respectant les conditions de température appropriées au matériel biologique.


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La traçabilité

La gestion informatique et la traçabilité des échantillons biologiques traités se font par l’intermédiaire du logiciel Biobase, développé à la Fondation, et qui a reçu l’agrément de la CNIL. Cette base de données communique avec l’ensemble des équipements de la chaîne de traitement des échantillons pour garantir leur traçabilité du prélèvement à la mise à disposition des échantillons dérivés.